1.血糖 血糖低于2.8mmol/L可确定为低血糖症。但低血糖常为发作性的，一两次血糖正常并不能排除此病，故应多次检查空腹、发作时的血糖来确定低血糖症。
2.血浆胰岛素 血胰岛素水平是病因诊断的重要依据。在低血糖发作时应同时抽血检测胰岛素水平。在血糖低而胰岛素水平高时有临床意义。
(1)血胰岛素(μU/ml)/血糖(mg/dl)比值：正常人此值<0.3，在血糖<50mg/dl时若此比值>0.4则表示胰岛素不适当分泌过多。常见于胰岛细胞瘤。应注意一次阴性结果不具有否定意义，对可疑者应多次检查和计算。
(2)胰岛素释放指数=[血胰岛素(μU/ml)×100]/[血糖(mg/dl)-30]，用扩大血胰岛素值、缩小血糖值来增加对低血糖诊断敏感性和准确性，对一些血糖很低而胰岛素不很高的患者更适用。正常人<50，肥胖者<80，>80表示胰岛素不适当分泌，特别是胰岛细胞瘤高于100甚至150。
3.血胰岛素原/总胰岛素 正常<15%。胰岛素瘤患者由于胰岛素合成旺盛，较多的胰岛素原来不及分解成胰岛素就被释放入血故此值升高。
4.糖耐量试验 可了解血糖和胰岛素的动态变化。方法有两种即5h口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和3h静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)。
口服葡萄糖耐量试验(OGTT)：空腹时口服葡萄糖粉1.75g/kg，总量不超过75g，测服糖前及服糖后30min和1、2、3、4、5h的血糖及胰岛素水平。整个试验5h，采血7次。此法常用。
3h静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)：空腹静脉注射葡萄糖0.5g/kg，总量不超过50g，于注射前及注射后30min和1、2、3h测血糖及胰岛素水平，整个试验3h，采血5次。不同病因的低血糖症糖耐量血糖曲线特点。
5.饥饿试验 对没有典型低血糖发作者，可行此试验来诱发低血糖。正常人或功能性低血糖者能耐受此试验，而90%以上胰岛素瘤患者在禁食24h后或终止前2h增加运动，可激发低血糖，少数需要延迟到48～72h才发作。在低血糖出现时血糖<50mg/dl，而胰岛素水平不下降，计算胰岛素/血糖比值升高(>0.4)。此项实验简便易行，但须在医生的监护下做此试验，试验过程中一旦出现低血糖症状应立即取血分别测血糖和胰岛素，同时给病人进食或注射高张糖以终止试验。
6.刺激试验包括 包括D860和胰升糖素试验。
(1)甲苯磺丁脲(D860)试验：有两种方法①口服法：试验前3日每日碳水化合物摄入量不少于300g，试验前一日晚餐后禁食。试验日晨口服D860 2.0g。于空腹和服药后0.5、1、2、3h抽血测血糖及胰岛素。病人在0.5～1h血糖下降到空腹的40%以下，至2～3h仍不能恢复，常诱发低血糖。②静脉法：用D860 1g钠盐溶于20ml注射用水，2min内静脉注入，每5min取血测血糖、胰岛素共3次，如胰岛素>195μU/ml则提示有胰岛素瘤的可能。
(2)胰升糖素刺激试验：于空腹或进食后6～8h，先采血测血糖，然后用胰高血糖素1mg静脉注射后每5min测胰岛素，如大于135μU/ml，提示胰岛素瘤的可能。
上述激发试验由于刺激胰岛素大量分泌而诱发低血糖，对病人比较危险，因此应严格掌握适应证，并且在医生监护下进行。
7.C肽抑制试验 静注胰岛素(0.1U/kg)后，引起低血糖从而抑制C肽释放。抑制率≥50%为正常，若不受抑制，则提示有自主分泌的胰岛素瘤。
影像学检查：对于胰岛大的腺瘤可采用超声波和CT来进行肿瘤定位，但大部分肿瘤瘤体较小(多数直径在5.5～10mm之间)，可采用选择性胰动脉造影和门静脉、脾静脉导管取血测定胰岛素和C肽含量来进行术前定位。
