直接胆红素/间接胆红素比值

基本信息

专科分类： 消化
检查分类： 肝功能检查
适用性别： 男女均适用
是否空腹： 　空腹
手术参考价： 10元
科　室： 消化

直接胆红素/间接胆红素比值检查简介

计算直接胆红素与间接胆红素之比值，有助于黄疸的类型和疾病的鉴别。

直接胆红素/间接胆红素比值检查过程

原理：

（1）改良咖啡因（J-G）法的原理：血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，产生偶氮胆红素；在同样条件下，游离胆红素需有加速剂使胆红素氢键破坏后与重氮试剂反应。咖啡因、苯甲酸钠为加速剂，醋酸钠维持pH同时兼有加速作用。抗坏血酸（或叠氮钠）破坏剩余重氮反应，终止结合胆红素测定管的偶氮反应，防止游离胆红素的缓慢反应。加入碱性酒石酸钠使最大吸光度由530nm转移到598nm，非胆红素的黄色色素及其他红与棕色色素产生的吸光度降至可略而不计，使灵敏度和特异性增加。最后形成的绿色是由蓝色的碱性偶氮胆红素和咖啡因与对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素混合而成。

（2）胆红素氧化酶法的原理：胆红素氧化酶（BOD）催化胆红素氧化，生成胆绿素，后者进一步氧化生成淡紫色化合物，在450nm波长比色，吸光度的下降值（△A）与血清胆红素浓度呈正比。

试剂：

（1）改良咖啡因（J-G）法：

①咖啡因-苯甲酸钠试剂：称取无水醋酸钠41.0g（或CH3COONa·3H2O63.0g），苯甲酸钠38.0g，乙二胺四乙酸二钠（EDT-ANa2）0.5g，溶于约500ml蒸馏水中，再加入咖啡因25.0g，搅拌使溶解（加入咖啡因后不能加热溶解），用蒸馏水补足至1000ml，混匀。用滤纸过滤，置棕色瓶，室温保存。

②碱性酒石酸钠溶液：称取氢氧化钠75.0g，酒石酸钠（Na2C4H4O6·H2O）263.0g，用蒸馏水溶解并补足至1000ml，混匀。置塑料瓶中，室温保存。

③5.0g/L亚硝酸钠溶液：称取亚硝酸钠（NaNO2）5.0g，用蒸馏水溶解并稀释到100ml，混匀，置棕色瓶中，冰箱保存，稳定不少于3个月。作10倍稀释成0.5g/L，贮冰箱稳定不少于2周。

④5.0g/L对氨基笨磺酸溶液：称取对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g/L，溶于800ml蒸馏水中，加入浓盐酸15ml，用蒸馏水补足至1000ml。

⑤重氮试剂：临用前取5.0g/L亚硝酸钠溶液0.5ml和5.0g/L对氨基苯磺酸溶液20ml混合。

⑥5.0g/L叠氮钠溶液：称取叠氮钠0.5g，以蒸馏水溶解并稀释至100ml。

⑦胆红素标准液

A.一般用游离（非结合）胆红素配制标准液，因此配制标准液的稀释剂需含白蛋白。可用牛血清白蛋白（40g/L）或人血清代替人血清白蛋白。后者方法如下：收集无溶血、无黄疸、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用滤菌器过滤。取过滤后的血清1ml，加入24ml新鲜生理盐水，混合。在414nm波长，1cm光径，以生理盐水调零点，其吸光度应小于0.100；在460nm的吸光度应小于0.04。

B.配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，在25℃条件下，光径10±0.01mm，波长453mm，摩尔吸光系数应在60700±1600范围内；改良J-G法偶氮胆红素的摩尔吸光系数应在74380±866。

C.胆红素贮存标准液，171μmol/L（10mg/dl）：准确称取符合要求的胆红素10mg，加入1ml二甲亚砜，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。加入0.05mol/L碳酸钠溶液2ml，使胆红素完全溶解，移入100ml容量瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入0.1mol/L盐酸2ml，边加边摇（勿用力，以免产生气泡）。最后以稀释用血清补足至100ml。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹。置4℃冰箱3天内有效，但要求配后尽快作标准曲线。

（2）胆红素氧化酶法：

①0.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.2：称取Tris1.211g，胆酸钠172.3mg，SDS432.6mg，溶于90ml蒸馏水中，在室温（25～30℃）用1mol/L盐酸调节pH至8.2（约用6ml），再加蒸馏水至100ml，置冰箱保存。此液含4mmol/L胆酸钠、150mmol/LSDS。

②BOD溶液：如系冻干品，按说明书要求复溶，但复溶后冰箱保存不宜过长（约可保存1周）。如系液体（可能含有甘油），置冰箱或冰室可保存较长时间，BOD贮存液的酶活性一般在数千至1～2万U/L，BOD工作液的酶活性可按反应液中BOD终浓度达0.3～1.0U/ml计算。

③胆红素标准液：342μmol/L：按胆红素测定J-G法配制，或市售合乎要求的标准液。

操作方法：

（1）改良咖啡因（J-G）法：按表1操作。

充分混匀后，波长600nm，对照管调零，读取各管吸光度；或用蒸馏水调零，读取测定管及对照管吸光度，用测定管吸光度与对照管吸光度之差（AU-AC），在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。

（2）胆红素氧化酶法：按表2进行操作。

加入BOD溶液后立即混匀，置37℃水浴5min，用分光光度计，在450或460nm波长，蒸馏水调零，读各管吸光度。用于对照管的比色杯与非对照管的比色杯不得混用。

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